蛋白质研究的基本实验方法

南昌大学基础医学院

生理教研室

邹惟莹

实验研究三个水平

整体水平：动物模型

细胞水平：形态、功能

分子水平：基因、蛋白质

蛋白质的调控

基因序列的变化：ErbB2

染色质水平上基因活化的调节：

染色质的结构（对核酸酶的敏感程度增加）

组蛋白的甲基化（H3-K9 基因沉默，H3-K4 基因活化）

组蛋白的乙酰化

DNA的甲基化（5%C 甲基化 m5C； 5’端CpG ）

蛋白质的调控

转录水平的调控

顺式作用元件，反式作用因子（转录因子）

转录后的调控

翻译水平的调控

翻译后调控

磷酸化、糖基化、泛素化

定位

蛋白质调控的研究

Qualitative model (cyclins)

Quantitative model (CDK)

蛋白质研究的基本方法

免疫印迹（Western Blot）

免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）

染色质免疫共沉淀（ChIP）

Western Blot

免疫印迹（蛋白质印迹）

是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。

是在凝胶电泳（高分辨率）和固相免疫测定技术（高特异性，高灵敏性）基础上发展而来。

Western Blot

Western Blot

A. Sample preparation

B. Electrophoresis

C. Transfer of proteins and staining (Western blotting)

蛋白裂解液的制备

组织样品：取适量（约100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml 含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。

细胞样品：每份样品取1×106～1×107 细胞，PBS 清洗细胞，去PBS，加0.1ml~1ml 含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。

蛋白裂解液的制备

蛋白裂解液的制备

RIPA Buffer：

裂解液和细胞应充分接触，RIPA buffer足量。

RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法但可用BCA法测定蛋白浓度。

蛋白裂解液的制备

当细胞破碎的时候，蛋白水解酶就会被释放出来或被激活。为了避免这些情况的出现，在样品制备时尽可能在

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